Organizarea muzeului a decurs în mod firesc din fondul patrimonial avut la dispoziţie şi tezaurizat în cei peste 155 de ani de existenţă și a inclus trei galerii: 
- Galeria de artă românească modernă - unde panotarea a vizat criteriul cronologic, începând cu sfârşitul secolului al XVIII-lea, până la perioada interbelică;
- Galeria de artă contemporană românească, în care un loc special a fost rezervat şcolii ieşene de arte plastice; 
- Galeria de artă europeană - structurată pe şcoli naţionale: italiană, spaniolă, flamandă-olandeză, germană, austriacă, rusă, poloneză.

Nucleul în jurul căruia s-a dezvoltat patrimoniul Muzeului de Artă îl constituie 12 picturi provenite din colecția Las Marismas, pe care revoluționarul pașoptist Scarlat Vârnav le-a achiziționat din capitala Franței, donându-le ulterior cu intenția de a „pune cu ele temelia unui muzeu de tablouri în capitala Moldovei, spre eterna sa memorie”. Pentru valoarea lor artistică și istorică, cele 12 picturi merită a fi menționate:

 

• Peter Paul Rubens – Cezar primind capul lui Pompei  
• Egbert van Hemskerk - Cafenea flamandă
• Francisco Antolinez Y Sarabia – Sfântul Ioan Botezătorul
• Philippe de Champaigne – Autoportret
• Școala lui Murillo – Pieta
• Bartolome Esteban Murillo – Fecioara în extaz
• Școala lui Murillo – Sfânta familie
• Pietro Liberi – Judita și Holofern
• Eustache le Sueur – Phaeton
• Felix Henri Philipoteux – Berezina
• Școală franceză (secolul XVII) – Mareșalul Villars
• Anonim – Capul Sfântului Ioan Botezătorul.

Decizia înființării la Iași a unui Muzeu de Artă, al cărui prim director a fost pictorul Gheorghe Panaiteanu Baradasare, a fost salutată de către mediile intelectuale ale timpului respectiv, care au și contribuit la îmbogățirea patrimoniului său.

Astfel, după mai puţin de un an de la inaugurare, în aprilie 1861, patrimoniul Pinacotecii s-a îmbogățit cu prețioasa colecție a lui Costache Negri, care pusese condiția ca „tablourile să rămână totdeauna neclintite la Iași”. Colecția lui Costache Negri era formată din 39 de tablouri, unele dintre ele atribuite unor pictori europeni celebri, precum: Van Dyck, Nicolas Poussin, Tintoretto, Paolo Cagliari Veronese, Francesco Solimena, Jan Both.

În perioada de început a Pinacotecii ieșene, colecției sale de pictură i s-au adăugat și lucrări provenite din donația avocatului Costache Dasiade, care cuprindea 30 de tablouri de artă europeană. O importantă donaţie pentru Muzeul de Artă din Iași a fost și cea din 1880, realizată de către Iancu Codrescu. Printre lucrările donate atunci se numără şi Portretul logofătului Teodor Balș, pictat de către unul dintre primii pictori români - Ion Balomir.

De-a lungul timpului, patrimoniul primului Muzeu de Artă din România, inaugurat la Iaşi, capitala culturală a României, în 1860, s-a îmbogăţit continuu cu noi şi valoroase opere de artă româneşti şi străine, provenite atât din donaţii, cât şi din achiziţii. În deceniul al treilea al secolului trecut, sub direcţia de doar patru ani a pictorului Ştefan Dimitrescu, colecţia Muzeului s-a extins cu un număr semnificativ de tablouri semnate de pictori români, printre care: Gheorghe Petraşcu, Theodor Pallady, Nicolae Tonitza, Camil Ressu, Nicolae Dărăscu, Sabin Popp, Octav Băncilă, Aurel Băeşu şi alţii.

O creştere semnificativă a fondului de artă străină s-a realizat în 1963, când în inventarele Pinacotecii din Iași a fost consemnat un număr important de tablouri semnate de maeştri europeni, dintre care îi amintim pe: Ricciarelli Daniele da Volterra, Felix Ziem, Peter van Bloemen, J. Cornelisz Droochloot, Johann Roos, Albert Decker şi alţii. 

În prezent, Muzeul de Artă din Iași tezaurizează aproximativ 10.000 de opere de artă: pictură, grafică, sculptură, care vor fi, treptat, valorificate în expoziții și, astfel, oferite publicului iubitor de frumos.